复苏步骤

复苏步骤

前期准备：

1. 资料准备：查阅说明书或相关文献，了解细胞的形态（表皮样or成纤维样or圆形）；明确细胞的生长特性（贴壁or悬浮）；明确细胞所需完全培养基(DMEM、RPMI-1640、DMEM/F-12)

2.操作准备：

①用70%酒精消毒双手；超净台需提前打开紫外线照射30min；打开37℃恒温水浴锅、离心机以及倒置显微镜；紫外线照射完毕，拉起玻璃罩至灯亮，打开风循环，灯重新亮起后才能进超净台操作。

②准备离心管（50ml+15ml）、移液管(5ml+10ml)、培养皿（贴壁细胞）或培养瓶（悬浮细胞、贴壁细胞均可）、枪头盒、移液枪。所有物品在进入操作台前用70%酒精消毒。

③配置好的细胞完全培养基（比如DMEM+10%FBS+1%Anti-Anti）

2、操作步骤：

①戴好手套，从液氮中取出需要解冻的冻存管（动作尽量快），将冻存管放入干冰中，快速拿到细胞培养室中。

②将冻存管放入37℃恒温水浴锅中不停晃动直至解冻（冻存管管口不能接触到水浴锅里的液体，避免造成污染）。

③细胞液解冻完后马上擦干并用70%酒精消毒冻存管，移入超净台。取一支15ml离心管用移液管吸取5毫升细胞对应完全培养基加入离心管中（这个步骤可放在操作第一步之前），再吸取冻存管里的细胞液，放入离心管中。

④将离心管放入离心机中进行离心，1500r，5分钟。

⑤在离心机运行过程中，准备新的培养皿或培养瓶。

⑥将离心管从离心机中取出，吸掉上清液，加入对应的培养基(10cm培养皿加8ml ;6cm培养皿加4ml；25ml培养瓶贴壁细胞加5ml,悬浮细胞8ml)，用移液管吹打均匀。

⑦吹打好后将细胞液全部移入新的培养皿或培养瓶中，摇晃均匀，把培养皿（培养瓶要拧紧瓶盖）放到显微镜下观察，是否成为单个的细胞个体，最后放入37℃恒温细胞培养箱。培养瓶放入培养箱后拧松瓶盖。（不带滤盖的培养瓶需要这样操作）

⑧拿酒精喷洒操作台，用纸从里到外擦拭一遍，将所有东西归位，拉下玻璃罩，打开紫外线照射30min⑩拿酒精喷洒操作台，用纸从里到外擦拭一遍，将所有东西归位，拉下玻璃罩，打开紫外线照射30min；显微镜用完光照调到最小，走之前离开前关机。