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冻存细胞步骤发表时间:2021-07-02 11:40 细胞冻存步骤 前期准备: 一.资料准备:查阅说明书或相关文献,了解细胞的形态(表皮样or成纤维样or圆形);明确细胞的生长特性(贴壁or悬浮);明确细胞所需完全培养基(DMEM、RPMI-1640、DMEM/F-12) 二.操作准备: ①准备:装有碎冰的盒子,打印冻存细胞的标签、冻存管 ②用70%酒精消毒双手;生物安全柜超净台打开紫外线照射30min;打开37℃恒温水浴锅、离心机以及倒置显微镜;紫外线照射完毕,拉起玻璃罩至灯亮,打开风循环,灯重新亮起后才能进操作台操作。 ③在超净台里,准备好冻存管,并贴上标签。 ④准备离心管(50ml+15ml)、移液管(5ml+10ml)、枪头盒、移液枪。所有物品在进入超净台前用70%酒精消毒。 ⑤试剂准备:PBS、胰蛋白酶(Trypsin):-20℃冰箱中取出,37℃水浴锅解冻(注意:不要摇晃离心管,以免溶液溅到管口易污染)。所有装试剂离心管用70%酒精消毒,再移入超净台。没用完试剂保存在4℃冰箱。 ⑥准备细胞相对应培养基(比如DMEM+10%FBS+1%Anti-Anti) ⑦冻存液准备:现用现配(细胞所需的完全培养基+10%DMSO),配好后置于碎冰盒里保凉,要用时用70%酒精消毒,再移入超净台。 三、操作步骤: (1)贴壁细胞 ①从培养箱中拿出细胞,培养皿入操作台,吸除上清液,加入PBS洗涤(加好后不要晃动以免细胞飘起)10cm培养皿加2ml PBS ,6cm培养皿加1ml PBS,T12.5培养瓶加1mlPBS,T25培养瓶加2ml PBS ②吸干净PBS,用移液管吹吸均匀胰酶,把胰酶加入培养皿(10cm培养皿加2ml ,6cm培养皿加1ml,T12.5培养瓶加1ml,T25培养瓶加2ml)。轻轻摇晃培养皿,使胰酶均匀覆盖。放入37℃细胞培养箱消化4~6min,打开计时器计时(每隔2分钟可去观察一次细胞是否消化下来) ③从培养箱中取出培养皿,放入倒置显微镜下观察细胞呈悬浮状,圆形即可(贴壁劳的细胞可以用移液枪吹打一下,细胞是否脱落),若细胞已呈悬浮状,则按1:1(胰蛋白酶:培养基)比例加入培养基混合,用移液管吹打均匀。 ④将吹打好的细胞液全部收集装入离心管中(根据细胞液选择不同容量的离心管),用移液管吹打均匀 ⑤用移液枪取10ul细胞悬液进行细胞计数(计数是为了计算出可以冻存的管数,保证每个冻存管中细胞数量至少有10*6/ml,才能不影响后续细胞复苏的问题) ⑥将装有细胞悬液的离心管放入离心机中进行离心,1500r,5min。若上清中还有细胞再离2-3分钟。 ⑦冻存液管用70%酒精消毒,再移入操作台,将离心管取出,吸掉上清液,把冻存液(冻多少管数加多少ml的冻存液)加有细胞的离心管中,用移液管吹打均匀。 ⑧每只冻存管中装入1ml的细胞悬液,将装好细胞悬液的冻存管拧紧放入梯度冻存盒中,迅速把梯度冻存盒拿到-80℃冰箱中冻存。 ⑨拿酒精喷洒操作台,用纸从里到外擦拭一遍,将所有东西归位,拉下玻璃罩,打开紫外线照射30min ⑩第二天需要去-80℃的冰箱中,把冻存一整夜的细胞转移到液氮罐中。
(2)悬浮细胞 ①从培养箱中拿出细胞培养瓶,拧紧瓶盖,移入操作台。 ②用移液管将细胞悬液吹吸均匀,将细胞悬液移入50ml离心管。 ③取10ul细胞液进行细胞计数(计数是为了计算出可以冻存的管数,保证每个冻存管中细胞数量至少有10*6/ml,才能不影响后续细胞复苏的问题) ④将装有细胞液的离心管离心,2000r,5min(不同离心机转速不一样,以实际能把细胞离心下来的转速为准) ⑤冻存液管用70%酒精消毒,再移入操作台。加入冻存液到有细胞的离心管中,用移液管吹打均匀(冻多少管数加多少ml的冻存液)。 ⑤每只冻存管中装入1ml的细胞悬液,将装好细胞悬液的冻存管拧紧放入梯度冻存盒中,迅速把梯度冻存盒拿到-80℃冰箱中冻存。 ⑥拿酒精喷洒操作台,用纸从里到外擦拭一遍,将所有东西归位,拉下玻璃罩,打开紫外线照射30min。
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