冻存细胞步骤

细胞冻存步骤

前期准备：

一.资料准备：查阅说明书或相关文献，了解细胞的形态（表皮样or成纤维样or圆形）；明确细胞的生长特性（贴壁or悬浮）；明确细胞所需完全培养基(DMEM、RPMI-1640、DMEM/F-12)

二.操作准备：

①准备：装有碎冰的盒子，打印冻存细胞的标签、冻存管

②用70%酒精消毒双手；生物安全柜超净台打开紫外线照射30min；打开37℃恒温水浴锅、离心机以及倒置显微镜；紫外线照射完毕，拉起玻璃罩至灯亮，打开风循环，灯重新亮起后才能进操作台操作。

③在超净台里，准备好冻存管，并贴上标签。

④准备离心管（50ml+15ml）、移液管(5ml+10ml)、枪头盒、移液枪。所有物品在进入超净台前用70%酒精消毒。

⑤试剂准备：PBS、胰蛋白酶（Trypsin）：-20℃冰箱中取出，37℃水浴锅解冻（注意：不要摇晃离心管，以免溶液溅到管口易污染）。所有装试剂离心管用70%酒精消毒，再移入超净台。没用完试剂保存在4℃冰箱。

⑥准备细胞相对应培养基（比如DMEM+10%FBS+1%Anti-Anti）

⑦冻存液准备：现用现配（细胞所需的完全培养基+10%DMSO），配好后置于碎冰盒里保凉，要用时用70%酒精消毒，再移入超净台。

三、操作步骤：

（1）贴壁细胞

①从培养箱中拿出细胞，培养皿入操作台，吸除上清液，加入PBS洗涤(加好后不要晃动以免细胞飘起）10cm培养皿加2ml PBS ，6cm培养皿加1ml PBS，T12.5培养瓶加1mlPBS，T25培养瓶加2ml PBS

②吸干净PBS，用移液管吹吸均匀胰酶，把胰酶加入培养皿（10cm培养皿加2ml ，6cm培养皿加1ml，T12.5培养瓶加1ml，T25培养瓶加2ml）。轻轻摇晃培养皿，使胰酶均匀覆盖。放入37℃细胞培养箱消化4～6min，打开计时器计时（每隔2分钟可去观察一次细胞是否消化下来）

③从培养箱中取出培养皿，放入倒置显微镜下观察细胞呈悬浮状，圆形即可（贴壁劳的细胞可以用移液枪吹打一下，细胞是否脱落），若细胞已呈悬浮状，则按1:1（胰蛋白酶：培养基）比例加入培养基混合，用移液管吹打均匀。

④将吹打好的细胞液全部收集装入离心管中（根据细胞液选择不同容量的离心管），用移液管吹打均匀

⑤用移液枪取10ul细胞悬液进行细胞计数（计数是为了计算出可以冻存的管数，保证每个冻存管中细胞数量至少有10*6/ml，才能不影响后续细胞复苏的问题）

⑥将装有细胞悬液的离心管放入离心机中进行离心，1500r,5min。若上清中还有细胞再离2-3分钟。

⑦冻存液管用70%酒精消毒，再移入操作台，将离心管取出，吸掉上清液，把冻存液（冻多少管数加多少ml的冻存液）加有细胞的离心管中，用移液管吹打均匀。

⑧每只冻存管中装入1ml的细胞悬液，将装好细胞悬液的冻存管拧紧放入梯度冻存盒中，迅速把梯度冻存盒拿到-80℃冰箱中冻存。

⑨拿酒精喷洒操作台，用纸从里到外擦拭一遍，将所有东西归位，拉下玻璃罩，打开紫外线照射30min

⑩第二天需要去-80℃的冰箱中，把冻存一整夜的细胞转移到液氮罐中。

（2）悬浮细胞

①从培养箱中拿出细胞培养瓶，拧紧瓶盖，移入操作台。

②用移液管将细胞悬液吹吸均匀，将细胞悬液移入50ml离心管。

③取10ul细胞液进行细胞计数（计数是为了计算出可以冻存的管数，保证每个冻存管中细胞数量至少有10*6/ml，才能不影响后续细胞复苏的问题）

④将装有细胞液的离心管离心，2000r,5min（不同离心机转速不一样，以实际能把细胞离心下来的转速为准）

⑤冻存液管用70%酒精消毒，再移入操作台。加入冻存液到有细胞的离心管中，用移液管吹打均匀（冻多少管数加多少ml的冻存液）。

⑤每只冻存管中装入1ml的细胞悬液，将装好细胞悬液的冻存管拧紧放入梯度冻存盒中，迅速把梯度冻存盒拿到-80℃冰箱中冻存。

⑥拿酒精喷洒操作台，用纸从里到外擦拭一遍，将所有东西归位，拉下玻璃罩，打开紫外线照射30min。